在太医院的工作经历，使他获益匪浅，为他编着《本草纲目》带来了积极的影响。
他有机会出入太医院的皇家药房及御药库，看到许多平时难得一见的贵重药材，深入了解其性状、形态和产地。同时，他能够广泛阅读皇家书库珍藏的各类医药典籍，使得眼界更加开阔，医学知识更加丰富。
他在太医院任职一年后，托病辞职返乡，在老家创立东璧堂，一边坐堂行医，悬壶济世，一边继续考察研究各类药物，编制本草之书。
公元1578年，此时已是明神宗万历年间，李时珍历时二十七年，终于完成《本草纲目》初稿。此后又经十余年三次修改，终成其书。这部伟大着作吸收了历代本草着作的精华，增益其所不足，“丰其屋，蔀其家，”是十六世纪以前中国最系统、最完整、最科学的医药学着作。
该书凡十六部五十二卷一百九十余万字，共辑录中医药单方则，收录本草1892种。其中含植物1195种，并附药物形态图1100余幅。
李时珍打破了自《神农本草经》以来的上、中、下三品分类法，开创性地把药物分为水、火、土、金石、草、谷、莱、果、木、器服、虫、鳞、介、禽、兽、人共十六部六十类。在书中分纲列目，系统清晰地记录了各种药物的历史、形态、功能和方剂应用等知识。这种按药物自然属性逐级分类的纲目体系，是现代生物分类学的重要方法。
《本草纲目》版本众多，大致可分为“一祖三系”，即祖本和江西本、钱本、张本三个体系。
祖本，又称金陵本，为该书的最早版本，也是经过李时珍家族亲自校订过的原始刊本，故称祖本。
公元1590年，金陵着名藏书家胡承龙“闚其户”，他找到李时珍承诺将《本草纲目》印刷发行。年逾古稀的李时珍欣然应允，“阒其无人，三岁不觌，凶，”他闭门不出，带着子弟全程参与该书的刻版校订工作。三年后，李时珍因病去世。这一年，他的二儿子李建元，带着刻成的《本草纲目》献于朝廷。
另外，江西本系统主要以公元1603年夏良心、张鼎思的刻本为基础；钱本系统以公元1640年钱蔚起的杭州六有堂刻本为主，《四库全书》据此本抄录；张本系统则以公元1885年张绍棠南京味古斋刻本为主。
《本草纲目》不仅为中国药物学的发展作出了重大贡献，而且对世界医药学、植物学、动物学、矿物学、化学的发展也产生了深远影响。时至今日，该书先后被译成十余种文字在全球出版，被誉为“东方医药巨典”。
李时珍因此被称为“药圣”。
除《本草纲目》以外，李时珍还编着了《濒湖脉学》，将临床脉象归纳成27种基本脉象，对中医理论和临床实践具有重大意义。他还创作了《奇经八脉考》，对人体奇经运行路线和诊治方法做出了有益探索。
